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新城疫病毒检测试剂盒使用步骤

产品型号:

厂商性质:生产厂家

访问量:34

更新时间:2020-06-22

简要描述:

【检验原理】

本试剂盒针对新城疫病毒基因组高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含新城疫病毒基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。

详细说明:

新城疫病毒检测试剂盒

【包装规格】 10头份/盒 & 50头份/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于新城疫病毒检测,可用于临床新城疫病毒感染的辅助诊断,但不作确诊使用。

【检验原理】

本试剂盒针对新城疫病毒基因组高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含新城疫病毒基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。

注:阴性对照为鸡基因组DNA,阳性对照为失去活性的新城疫病毒cDNA。

【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反复冻融,有效期12个月。

【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。

【样本要求】

1.活禽样品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下:

(1) 咽喉拭子,采取时要将拭子深入喉头及上愕裂来回刮3次~5次,取咽喉分泌液;

(2) 泄殖腔拭子,将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便;

(3) 将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理盐水的离心管中备用。

2.血液或血清样品:使用无菌注射液抽取样品置于离心管中待检。

3.肌肉或内脏样品:取少量样品(2~3克)于研钵或匀浆器中研磨,然后将研磨匀浆转入无菌离心管中,3000rpm/min 离心10分钟取上清待检。

4.应避免标本间交叉污染。

5.标本收集后可立即检测;若不能立即检测,可置于2~8℃冷藏过夜保存;如需长期保存,标本应冻存于-80℃以下,避免反复冻融。

【检验方法】

1. 试剂准备(试剂准备区)

(1)从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

(2)核算当次实验所需要的反应数(n),并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。

n =阴性对照数(1T)+阳性对照数(1T)+误差预留量(1T)+样本数

单反液配制表(每份)

RT-PCR反应液

15.0 μL

逆转录酶

 2.0 μL

Taq酶

 3.0 μL

 (3)在无菌离心管中加入上述试剂,充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。

2.样本准备(样本处理区)

用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA,具体操作按照其试剂盒说明书操作。

3.加样

 在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本RNA各5 μl、终体积25 μl/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品,终体积为25 μl/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器上。

4. PCR(PCR扩增区)

(1)取样本处理区准备好的PCR反应管,放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置,并记录放置顺序。

(2)按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。

 

反应体积

25 μL

通道选择

FAM通道采集新城疫病毒荧光信号

PCR

反应

条件

步骤

条件

循环数

反转录

    42℃:10分钟(min)

1

预变性

95℃:3分钟(min)

1

预扩增

95℃:5秒(s)

5

55℃:40秒(s)

PCR扩增

95℃:5秒(s)

40

55℃:40秒(s)

(此阶段结束时采集荧光信号)

 

注:ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正,设置淬灭基团选择None。

【参考值(参考范围)】

1.试剂盒有效性判定:

(1)阳性对照:有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。

(2)阴性对照:Ct值>38或无Ct值,线形为直线或轻微斜线,无指数增长期。

2.标本结果判定:

(1)阳性:标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。

(2)可疑:标本检测结果Ct值在35~38范围内。此时应对标本进行重复检测,如重复实验结果Ct值仍在35~38范围内,有明显指数增长期,则判定为阳性,否则为阴性。

(3)阴性:标本检测结果Ct值>38或无Ct值。

【检验结果的解释】

通道及检测结果

标本检测结果解释

FAM

+

标本中检出新城疫病毒RNA

-

标本中未检出新城疫病毒RNA

 

 



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