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单层细胞传代培养时常出现的问题

发布时间:2020-06-05   点击次数:457次
1. 细胞难脱离
 
• 培养基内含有某些抑制成分(例如血清)使细胞解离液失活。
 
解决对策:在加入细胞解离液(dissociating solution)之前,先用DPBS润洗细胞两次或者是直接用细胞解离液润洗细胞。
 
• 选用的细胞解离液太弱。
 
解决对策:提高酶浓度、EDTA浓度,或者使用作用更强的细胞解离液(如dispase, collagenase),或者是把细胞置于37°C孵育以提高解离液的活性。
 
• 细胞达到100%汇合时间太久,细胞间连接变得非常牢固,阻碍了解离液渗透到细胞与培养基质接触的界面。
 
解决对策:当细胞达到大约70%-90%汇合时,即进行传代。
 
2. 细胞脱离下来后聚集成团(Clumps)
 
• 分离过程太剧烈,导致细胞裂解释放基因组DNA。原因有二:一,移液枪吹打太剧烈;第二,选用的细胞解离液太强或有毒性,导致pH或渗透压异常。
 
解决对策:往细胞悬液内加入一滴无菌DNAse (1 mg/ml in water)使DNA链断裂。在随后的操作中,注意温和吹打细胞悬液,缩短孵育时间,换用弱一点的细胞解离液或者在低一点的温度下孵育。
 
• 如果收集的单细胞悬液没有立即加入培养基稀释并接种到新的培养皿内继续培养,而是在室温放置一段时间。这种情况下,细胞也有可能会聚集成团。
 
解决对策:将细胞悬液放置在冰上。
 
• 细胞悬液离心去除多余解离液时,离心太剧烈或时间过久。
 
解决对策:确保温和离心,推荐使用125g离心10 min。
 
3. 细胞重新贴壁困难
 
• 细胞解离过程持续时间过长,使得存在于细胞膜上的细胞附着所必需的蛋白剥离。
 
• 培养基内缺少足够的血清或黏附因子(常见于无血清培养基)。
 
解决对策:往培养基内添加黏附因子或者选用蛋白(collagen, poly-L-lysine, fibronectin, gelatin, etc.)包被过的培养容器。
 
• 未失活细胞解离液或者离心去除细胞解离液。
 
解决对策:在培养基内添加额外的血清或特异性酶抑制剂(例如,大豆胰蛋白酶抑制剂)中和细胞解离液。亦或使用125g离心5min去除细胞解离液,然后使用新鲜培养基重悬细胞。
 
4. 细胞活力低
 
• 细胞分离过程太剧烈
 
解决对策:自行摸索解离时间。
 
• 配制细胞分离液所用的平衡盐溶液(Balanced Salt Solution)pH或渗透压异常。
 
解决对策:测量pH或渗透压或直接换一瓶新的平衡盐溶液。
 
• 在重新接种之前,单细胞悬液以非常高的细胞密度在室温放置时间过长。
 
解决对策:将细胞悬液置于冰上。
 
• 培养基选择不恰当。
 
解决对策:推荐使用与原代细胞相配套的专属培养基。
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