欢迎您,来到赛诺利康生物技术(北京)有限公司!

返回首页|在线留言|联系我们

服务热线:

86-010-80765002

您现在的位置:首页 > 技术文章 > 单层培养传代步骤
产品列表

单层培养传代步骤

发布时间:2020-06-02   点击次数:89次
 绝大多数有限细胞系及连续细胞系在体外进行原代培养时都是贴壁生长的,培养的细胞一经接触培养基质就迅速铺展并开始有丝分裂,逐渐形成致密的细胞单层,这种培养方式称为单层细胞培养。
 
单层培养的细胞系在进行原代培养时,随着培养时间的延长和细胞的不断分裂,一则细胞之间相互接触而发生接触抑制,生长速度减慢甚至停止;另一方面由于营养物质消耗殆尽、代谢废弃物不断积累,导致细胞停止生长甚至死亡。此时,为获得大量的、稳定的同种细胞,并保证细胞始终维持快速生长,可以将单层细胞从培养基质上分离下来制成单细胞悬液,按照推荐浓度接种到若干个新的培养器皿内继续培养,这个过程就称为传代(Passage)或再培养(Subculture)。
 
单层细胞传代培养,需要将细胞间及细胞与培养基质之间的连接打断。对于某一些松散贴壁的细胞类型,只需轻敲培养器皿侧面,细胞就会脱离下来。绝大多数贴壁细胞需要使用蛋白水解酶例如,trypsin/EDTA消化破坏上述连接。还有少数细胞需要使用机械力,例如使用细胞刮,使细胞分离下来。对单层培养而言,细胞生长接近指数生长期末时(大约70%-90%汇合),即可进行传代。一般生长稳定的细胞4~7天传代一次。
 
单层培养传代步骤:
 
1. 事先将培养基、Trypsin-EDTA溶液、Trypsin中和液、DPBS在室温平衡,并准备若干已包被好poly-L-lysine或Fibronectin等的培养器皿。
 
注:不推荐使用37℃水浴锅对上述溶液进行平衡。
 
2. 将长满细胞的培养器皿中原有培养液吸弃,DPBS洗涤细胞1-2次。
 
3. 加入适量(略盖过细胞即可)Trypsin-EDTA溶液室温孵育0.5-2 min,不定时在显微镜下观察细胞状态,直至约80%细胞收缩、变圆突起(round up),立即加入等体积Trypsin中和液终止消化。
 
注:不同类型细胞消化时间长短不一,佳消化时间需自行摸索。
 
4. 轻轻晃动培养容器使细胞脱离,并将消化下来的细胞收集、转移到离心管内。另取适量完全培养基润洗培养容器,将残留的细胞一并转移至离心管。
 
注:细胞收集完毕后,可以在显微镜下观察培养容器内还有多少细胞残留(通常应少于5%),以此判断细胞收获是否彻底。 
 
5. 将收获的细胞悬液于1000rpm下离心5min,弃上清,然后用适量完全培养基重悬细胞。
 
6. 计数细胞,然后根据推荐的接种密度重新接种到新的已包被好的培养皿内。将培养器皿置于37℃, 5% CO2/95% air培养箱培养,视细胞生长情况,每隔2-3天换一次液,详见datasheet。
 
注:有限细胞系的增殖速率较低,其原代培养通常以1:1,1:2或1:3的比例进行传代,但是对于增殖速率很高的连续细胞系(或无限细胞系),通常要以更高的比例进行传代。
在线客服 联系方式 二维码

服务热线

13911051536

扫一扫,关注我们