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禽流感病毒H7N9亚型检测试剂盒

产品型号:

厂商性质:生产厂家

访问量:72

更新时间:2020-04-09

简要描述:

禽流感病毒H7N9亚型检测试剂盒(双色实时荧光PCR法)针对AIV-H7N9高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含AIV-H7N9基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。

详细说明:

禽流感病毒H7N9亚型检测试剂盒(双色实时荧光PCR法)

【包装规格】 25头/盒 50头/

【预期用途】

禽流感病毒H7N9亚型检测试剂盒(双色实时荧光PCR法)利用实时荧光PCR原理,定性检测禽流感病毒H7N9亚型(AIV-H7N9),对AIV-H7N9引起的禽流感诊断和监控具有重要指导意义。

【检验原理】

禽流感病毒H7N9亚型检测试剂盒(双色实时荧光PCR法)针对AIV-H7N9高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含AIV-H7N9基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。


注:阴性对照为禽类基因组DNA,阳性对照为失去活性的AIV-H7N9病毒cDNA

【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反复冻融,有效期12个月。

【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480Cepheid SmartCyclerRotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。

【样本要求】

1.样品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下:

咽喉拭子,采取时要将拭子深入喉头及上颚裂来回刮3次~5次,取咽喉分泌液;将咽喉拭子放人盛有1.0mL生理盐水的离心管中备用,应避免标本间交叉污染。

2.标本收集后可立即检测;若不能立即检测,可置于28冷藏过 夜保存;如需长期保存,标本应冻存于-80℃,避免反复冻融。

【检验方法】

1. 试剂准备(试剂准备区)

1)从冰箱中取出试剂盒从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

2)核算当次实验所需要的反应数(n),并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。

n =阴性对照数(1T+阳性对照数(1T+误差预留量(1T+样本数

单反液配制表()

RT-PCR反应液

15.0 μL

逆转录酶

 2.0 μL

Taq

 3.0 μL

3)在无菌离心管中加入上述试剂,充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。

2.样本准备(样本处理区)

QIAGENRoche公司RNA提取试剂盒提取RNA,具体操作按照其试剂盒说明书操作。

3.加样

    在上述制备好的PCR反应管中分别加入处理好的待测标本RNAμl、终体积25 μl/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器上。

    根据需要,在上述准备好的PCR反应管中分别加入阴性对照品以及阳性对照品各μl,终体积为25 μl/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器上。

4. PCRPCR扩增区)

1)取样本处理区准备好的PCR反应管,放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置,并记录放置顺序。

2)按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。 

反应体积

25 μL

通道选择

FAM通道采集 AIV-H7荧光信号

HEX通道采集 AIV-N9荧光信号

 PCR

反应

条件

步骤

条件

循环数

反转录

4210分钟(min

1

预变性

953分钟(min

1

预扩增

955秒(s

5

5540秒(s

PCR扩增

955秒(s

40

5540秒(s

(此阶段结束时采集荧光信号)

注:ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正,设置淬灭基团选择None

【参考值(参考范围)】

1.试剂盒有效性判定:

1)阳性对照:有典型S型扩增曲线或Ct≤35

2)阴性对照:Ct值>38或无Ct值,线形为直线或轻微斜线,无指数增长期。

2.标本结果判定:

1阳性:标本检测结果Ct≤35或有明显指数增长期。

2)可疑:标本检测结果Ct值在3538范围内。此时应对标本进行重复检测,如重复实验结果Ct值仍在3538范围内,有明显指数增长期,则判定为阳性,否则为阴性。

3)阴性:标本检测结果Ct值>38或无Ct值。

【检验结果的解释】

通道及检测结果

标本检测结果解释

FAM

HEX

+

+

样本中检测出AIV-H7AIV-N9

+

-

样本中检测出AIV-H7,未检测出AIV-N9

-

+

检测出AIV-N9,未检测出AIV-H7

-

-

未检测出AIV-H7AIV-N9

【检验方法的局限性】

1. 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的*检出限时可能会发生假阴性的结果。

2. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。

3. 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染,则容易得到假阳性结果。

【产品性能指标】 产品的*检出限为10Copies/mL,产品CV≤5%

【注意事项】

1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作,各区实验服、仪器、耗材应独立使用,不能混用;实验用吸头采用带滤芯吸头;样本处理区应配有生物安全柜,样本处理在生物安全柜中进行操作;三个区应该配有紫外线杀菌装置。

2. 为避免RNA降解,样本处理过程应在0-4℃条件下操作,且完成实验后立即上机检测;样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。

3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。

4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀,并应瞬时离心。

5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在第1次使用前应全部转移至标本准备区,并单独存放。

6. 为防止荧光干扰,应避免裸手直接接触PCR反应管,并应避免在PCR反应管上进行任何标记。



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