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新城疫病毒检测试剂盒(实时荧光PCR法)

产品型号:

厂商性质:生产厂家

访问量:220

更新时间:2020-04-09

简要描述:

新城疫病毒检测试剂盒(实时荧光PCR法)针对新城疫病毒基因组高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含新城疫病毒基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。

详细说明:

新城疫病毒检测试剂盒(实时荧光PCR法)

【产品名称】

通用名称:​新城疫病毒检测试剂盒(实时荧光PCR法)

英文名称:Newcastle disease virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】 10/盒 & 50/

【预期用途】

本试剂盒适用于新城疫病毒检测,可用于临床新城疫病毒感染的辅助诊断,但不作确诊使用。

【检验原理】

​新城疫病毒检测试剂盒(实时荧光PCR法)针对新城疫病毒基因组高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含新城疫病毒基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。

【主要组成成份】

序号

组成

10/

50/

1

ND病毒RT-PCR反应液

150 μL×1

750 μL×1

2

ND病毒逆转录酶

 20 μL×1

100 μL×1

3

ND病毒Taq

 30 μL×1

150 μL×1

4

ND病毒阳性对照

 40 μL×1

 40 μL×1

5

ND病毒阴性对照

 40 μL×1

 40 μL×1

6

说明书

1

1

注:阴性对照为鸡基因组DNA,阳性对照为失去活性的新城疫病毒cDNA

【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反复冻融,有效期12个月。

【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480Cepheid SmartCyclerRotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。

【样本要求】

1.活禽样品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下:

(1) 咽喉拭子,采取时要将拭子深入喉头及上愕裂来回刮3次~5次,取咽喉分泌液;

(2) 泄殖腔拭子,将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便;

(3) 将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理盐水的离心管中备用。

2.血液或血清样品:使用无菌注射液抽取样品置于离心管中待检。

3.肌肉或内脏样品:取少量样品(23克)于研钵或匀浆器中研磨,然后将研磨匀浆转入无菌离心管中,3000rpm/min 离心10分钟取上清待检。

4.应避免标本间交叉污染。

5.标本收集后可立即检测;若不能立即检测,可置于28冷藏过夜保存;如需长期保存,标本应冻存于-80℃以下,避免反复冻融

【检验方法】

1. 试剂准备(试剂准备区)

1)从冰箱中取出试剂盒从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

2)核算当次实验所需要的反应数(n),并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。

n =阴性对照数(1T+阳性对照数(1T+误差预留量(1T+样本数

单反液配制表()

RT-PCR反应液

15.0 μL

逆转录酶

 2.0 μL

Taq

 3.0 μL

 (3)在无菌离心管中加入上述试剂,充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。

2.样本准备(样本处理区)

QIAGENRoche公司RNA提取试剂盒提取RNA,具体操作按照其试剂盒说明书操作。

3.加样

 在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本RNA5 μl、终体积25 μl/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品,终体积为25 μl/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器上。

4. PCRPCR扩增区)

1)取样本处理区准备好的PCR反应管,放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置,并记录放置顺序。

2)按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。

 

反应体积

25 μL

通道选择

FAM通道采集新城疫病毒荧光信号

PCR

反应

条件

步骤

条件

循环数

反转录

    42℃10分钟(min

1

预变性

95℃3分钟(min

1

预扩增

95℃5秒(s

5

55℃40秒(s

PCR扩增

95℃5秒(s

40

55℃40秒(s

(此阶段结束时采集荧光信号)

 

注:ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正,设置淬灭基团选择None

【参考值(参考范围)】

1.试剂盒有效性判定:

1)阳性对照:有典型S型扩增曲线或Ct≤35

2)阴性对照:Ct值>38或无Ct值,线形为直线或轻微斜线,无指数增长期。

2.标本结果判定:

1阳性:标本检测结果Ct≤35或有明显指数增长期。

2)可疑:标本检测结果Ct值在3538范围内。此时应对标本进行重复检测,如重复实验结果Ct值仍在3538范围内,有明显指数增长期,则判定为阳性,否则为阴性。

3)阴性:标本检测结果Ct值>38或无Ct值。

【检验结果的解释】

通道及检测结果

标本检测结果解释

FAM

+

标本中检出新城疫病毒RNA

-

标本中未检出新城疫病毒RNA

【检验方法的局限性】

1. 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的*检出限时可能会发生假阴性的结果。

2. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。

3. 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染,则容易得到假阳性结果。

【产品性能指标】 产品的*检出限为102 Copies/mL,产品CV≤5%

【注意事项】

1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作,各区实验服、仪器、耗材应独立使用,不能混用;实验用吸头采用带滤芯吸头;样本处理区应配有生物安全柜,样本处理在生物安全柜中进行操作;三个区应该配有紫外线杀菌装置。

2. 为避免RNA降解,样本处理过程应在0-4℃条件下操作,且完成实验后立即上机检测;样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。

3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。

4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀,并应瞬时离心。

5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在第1次使用前应全部转移至标本准备区,并单独存放。

6. 为防止荧光干扰,应避免裸手直接接触PCR反应管,并应避免在PCR反应管上进行任何标记。

7. 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置;不同批号试剂不能混用。

8. ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正,淬灭基因选择None

9. 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。

 



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